当前位置: 首页 > >

二园艺植物cDNA文库的构建ppt课件共19页

发布时间:

二、园艺植物cDNA文库的构建 (一)普通cDNA文库的构建 3. 双链cDNA的合成 ①自身引导合成法 利用新合成的单链cDNA 3?末端反转所形成的发 夹的双链部分作为引物,引导DNA聚合酶以 cDNA为模板,合成互补的第二链cDNA,反应 结束后,用S1核酸酶降解发夹环的单链部分 ,即可得到双链的cDNA片段。 主要缺点是在用S1核酸酶去除发夹环时的反应 条件要求极为苛刻,难以控制,目前已极少采 用。 二、园艺植物cDNA文库的构建 ? (一)普通cDNA文库的构建 3. 双链cDNA的合成 ②置换合成法 利用Rnase H将杂交双链中的mRNA降解,形成多段仍与cDNA第 一链保持杂交的RNA片段. 利用这些RNA片段作为引物,引导合成第二链cDNA. 随着合成产物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作为引物的 RNA片段均被新合成的互补链所置换. 通过DNA连接酶作用,将各段互补链连接成完整DNA链。 除去残存的5末端RNA片段,并用T4DNA聚合酶削*3端突出的 单链cDNA,得到一个双链形式的cDNA片段. 该方法直接利用第一链反应产物,避免了中间处理和纯化过程造 成的cDNA损失,是目前合成cDNA第二链的常用方法. 二、园艺植物cDNA文库的构建 ? (二)新型cDNA文库的构建 ? 1. PCR介导的cDNA文库 ? 原理: 以cDNA第一链为模板,设计一组引物,通过 PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。 ? 优点:增加低丰度mRNA的克隆机会;利用仅有的几 个细胞或微量的mRNA建立较大的cDNA文库。 ? 缺点:PCR合成的片段一般较短,大片段的全长扩 增困难;扩增过程中错误掺入率甚高;由于PCR对 短片段的扩增效率高于长片段,故mRNA的原始丰 度难以在文库中体现。 ? 应用:适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因。 二、园艺植物cDNA文库的构建 ? (二)新型cDNA文库的构建 ? 2. 标准化cDNA文库 ? 定义:某一特定组织或细胞的所有表达基因均 包含其中,且含量相等的cDNA文库。 ? 优点: ? 增加了克隆丰度极低的mRNA的机会。 ? 能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录 区。 ? 能估计大多数基因的表达水*,并发现组织特 异性基因。 二、园艺植物cDNA文库的构建 ? (二)新型cDNA文库的构建 ? 2. 标准化cDNA文库 ? 构建方法 ? 用基因组DNA做选择杂交,所捕获的cDNA丰度 与对应的基因组DNA丰度一致,其缺点是约 20%的非单一拷贝基因在构建的文库中丰度偏 高。 ? 根据cDNA退火的二级动力学特征,即稀有拷 贝的cDNA较丰度拷贝的cDNA复性或杂交慢, 使未复性部分的单链cDNA渐趋等化。 三、目的基因的筛选 ? 1. 根据目的基因的核苷酸序列筛选 ? 根据基因序设计引物,以基因组DNA或mRNA 反转录的cNDA为模板进行PCR扩增.如果得到 的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作 为探针筛选cDNA文库和基因组文库获得全长 基因. ? 用探针直接筛选库,若能得到其它植物已分离 的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA文 库和基因组文库,获得研究植物的目的基因. 三、目的基因的筛选 ? 2. 根据目的基因的核苷酸序列筛选 ? 如果已知基因表达产物(蛋白质)的氨基酸序列, 就可以反推出原来基因的核苷酸序列。 ? 从N端对10多个连续的氨基酸进行序列测定, 选择连续6个以上简并程度最低的氨基酸,按 各种可能的序列结构合成寡核苷酸探针库,从 cDNA文库和基因组文库中筛选全长的基因. ? 缺点:在实验中得到纯度高、数量足够的目的 基因表达产物(蛋白质)是很困难的,蛋白质测序 也花费较高,难度较大. 三、目的基因的筛选 ? 3. PCR法筛选基因文库 ? 将基因文库分装96孔培养板. ? 培养一段时间后,分别从同一行或同一列孔中吸取 少量培养物合并。 ? 以此混合物为模板进行PCR扩增,根据凝胶电泳的 结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆。 ? 对含有阳性克隆的行或列孔中培养物再次分装,经 培养后进行第二轮PCR扩增。 ? 如此反复操作,直至获得阳性克隆。 一、分离基因的程序 ? (一) 图位克隆技术的定义及原理 ? 定义:根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的 一种方法. ? 原理:首先找到一个是以与目标基因相连的DNA分子标 记,然后通过染色体步移技术克隆分离出目标基因. ? 当基因与标记之间的距离小于基因组文库中克隆的* 均插入片段大小时,就要可直接筛选到含有目标基因的 克隆,这种方法称为染色体登陆(chromosome landing ) 一、分离基因的程序 ? (二) 分离基因的程序 ? ①目的基因的初步定位 利用分子遗传图谱确定与目的基因连锁的分子标 记。 ? ②目的基因区域的物理作图 将分子标记之间的遗传距离(cM)转化为物理距 离(碱基数),构成该基因区域的物理图谱. ? ③构建并筛选含有大插入片段的基因组文库. 用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选大片段基 因组文库,获得阳性克隆。 一、分离基因的程序 ? (二) 分离基因的程序 ? ④构建目的基因区域跨叠克隆群 以阳性克隆的末端作为探针筛选基因组文库,获得 含有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠群 ? ⑤目的基因的精细定位和染色体登陆 以目标基因两侧的分子标记为探针,通过染色体 登陆获得含目标基因的阳性克隆。 ? ⑥外显子的分离和鉴定 利用筛选cDNA文库,外显子捕捉等技术获得候选 基因,通过功能互补实验确定目标基因。 二、cDNA末端快速扩增技术 ? 1.基本步骤 ? 从GenBank等公共数据库中,比较分析待克 隆基因的保守序列区段。 ? 以此保守序列设计特异或简并引物,从待 测植物组织的cDNA中进行PCR扩增,获得 待分离基因的cDNA片段. ? 通过RACE技术获得cDNA的5?和3?端,并与 已知基因序列进



友情链接: